金花葵植株不同部位总黄酮、总多糖含量测定
测定说明：
①黄酮类化合物提取方法有溶剂法、微波法、酶解法、超临界流体萃取法、双水相萃取法、超声波提取法，本试验采用最常用的溶剂法——80%乙醇浸提法。
②黄酮含量测定方法有分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、超临界流体色谱法、薄层扫描法，本试验采用最常用的分光光度法测定黄酮含量。
③植物活性多糖的提取方法有多种，在水提醇沉的基础上，常采用酶解、微波、超声波，膜处理和CO2超临界萃取等方法进行辅助提取，最常用的还是水提醇沉法，本试验采取此法对样品进行前处理，用蒽酮比色法测定多糖含量。
2011年在北京东方红园区进行了金花葵试验种植，北京农科院草业研究中心试验室对金花葵植株不同部位总黄酮、总多糖含量进行了测定，结果如下：
一、分析仪器：
9600UV紫外可见分光光度计；沙多利斯电子分析天平；水浴锅；植物万能粉碎机；电热鼓风干燥箱；5000ul可调取液器。
二、化学试剂：
1、1000ug/ml葡萄糖标准液：分析纯葡萄糖经105度烘干3小时，称取1.0000g放入1000ml容量瓶中，用纯水溶解并用纯水定容。
2、400ug/ml芸香甙(芦丁)：称取105度烘干芦丁0.4000g溶于80%乙醇中并定容到1000ml。
3、80%乙醇：取800ml无水乙醇，加入200ml纯水并摇匀。
4、5%NaNO2：50g NaNO2溶于纯水并定容1000ml。
5、10%AlNO3：100g AlNO3溶于纯水并定容1000ml。
6、1mol NaOH：40g NaOH溶于纯水并定容1000ml。
7、蒽酮试剂：0.2g蒽酮溶于100ml浓H2SO4中，当日配制使用。
三、样品的制备
1、花样品：在金花葵下部果实开始成熟时，选摘伸展开的鲜花，放入塑料食品袋中，放入冷冻室中保存，用三次采集的花均匀抽取30朵放在瓷盘上，放入干燥箱中70度烘干，用植物万能粉碎机粉成40目，放入干燥器中备用，此样品为5号样。
2、其它样品：选择挖取采收果实后的有代表性的正常植株4株，用自来水冲洗去根部的泥土，放入干燥箱中70度烘干，分别截取从地表到上部40cm主茎、枝杈下部40cm、地表到下边的根部、主茎和枝杈的上部为样品材料，用剪刀剪成1-2cm长度后，分别用植物万能粉碎机粉成40目，放入干燥器中备用，此样品分别为1号、2号、3号、4号样品，放入干燥器中备用。
四、测定分析操作步聚
1、样液的制备：根据总黄酮、单糖和寡糖可用80%的乙醇提取，而多糖不溶于80%的乙醇却溶于水的特点，样液的制备分两步走。
(1)植物总黄酮样液的制备：分别用电子分析天平称取金芙蓉样品2.000×g放入50ml刻度试管中，加入40ml左右80%的乙醇，搅拌后加盖放入水浴锅中，80度加热浸提，中间搅拌一次，1小时后取出将上清液到入200ml容量瓶中，再加入80%的乙醇40ml，80度浸提30分钟，上清液到入200ml容量瓶中，以此再反复操作3-4次，最后用80%乙醇定容到200ml摇匀，此为测定总黄酮的样品溶液。
(2)植物多糖样液的制备：提取完植物总黄酮的样品可作为继续提取植物多糖的样品，分加入40ml左右的纯水，搅拌后加盖放入水浴锅中，95度加热浸提，中间搅拌一次，1小时后取出将上清液到入200ml容量瓶中，再加入纯水40ml，95度浸提30分钟，上清液到入200ml容量瓶中，以此再反复操作3-4次，最后用纯水定容到200ml，摇匀后作为测定植物多糖的样品溶液。
2、样品的测定：
(1)总黄酮的测定：
A、样品待测液的制备：分别吸取用于测定总黄酮的待测样液10ml放入石英蒸发皿中，在80度水浴锅上加热蒸干，用纯水洗入100ml容量瓶中，定容摇匀。
B、系列标准液制备：分别吸取400ug/ml标准母液0ml、2ml、4ml、6ml、8ml、10ml放入50ml试管中，分别用80%乙醇补齐到10ml并摇匀。其浓度分别为0ug/ml、80ug/ml 、160ug/ml、240 ug/ml、320 ug/ml、400 ug/ml。
C、标液和样液显色：分别吸取各标液2ml放入50ml试管中，加入4ml纯水，0.6ml5%NaNO2并摇匀，放置6分钟，加入10%Al(NO3)30.6ml，6分钟再加入1mol NaOH 8ml，摇匀，用纯水定容到20ml，摇匀后半小时比色测定；分别取样液2ml放入50ml试管中，加入2ml纯水，2ml80%乙醇，0.6ml 5%NaNO2并摇匀，放置6分钟，加入10%Al(NO3)30.6ml6，分钟再加入1 mol NaOH 8ml，摇匀，用纯水定容到20ml，摇匀后半小时比色测定。
D、上机测定：取显色后的0ug/ml、80ug/ml、240ug/ml、400ug/ml标准液分别放入4个比色皿中，分别输入浓度用500nm波长比色建立标准曲线，然后将显色稳定后的样液上机比色，仪器直接显示比色浓度。
表1、金花葵植株不同部位生物总黄酮含量
样品
号
样品
名
比色浓度
ug/ml
提取液定容体积
ml
稀释
倍数
称样量
g
含量
%
1
茎下部
64
200
5
2.000
3.20
2
枝条下部
44
200
5
2.000
2.20
3
根
50
200
5
2.000
2.50
4
枝条上部
63
200
5
2.000
3.15
5
花
365
200
5
2.000
18.25
测定完样品后，又对标准液浓度进行了测定，结果如下：
表2、标准液浓度测定结果
设定浓度ug/ml
80
240
320
400
比色浓度ug/ml
80
239
320
399
表2结果表明，标准曲线线性好，显色稳定，结果可靠。
(2)植物多糖的测定：
由于可溶性的单糖和寡糖与植物多糖都可用同一种方法—蒽酮比色法测定，所以在测定多糖的同时，将非多糖(可溶性糖)一并测出。
A、样液制备：以测总黄酮待测液为可溶性糖待测1、2、3、4、5号样液，吸取测多糖样液10ml放入100ml容量瓶中用纯水定溶并摇匀为测多糖待测液，分别为1ˊ、2ˊ、3ˊ、4ˊ、5ˊ号样。
B、标准液制备：分别吸取1000ug/ml葡萄糖标准母液0ml、1ml、2ml、4ml、6ml、8ml、10ml，分别放入100ml容量瓶中，用纯水定容，此为0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40 ug/ml、60ug/ml、80ug/ml、100ug/ml系列标准液。
表3、标准液配制表
管号
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖标准液（mL）
0
1
2
4
6
8
10
蒸馏水（mL）
100
90
80
60
40
20
0
葡萄糖含量（?g/mL）
0
10
20
40
60
80
100
分别吸取系列标准液、1-5号和1ˊ-5ˊ号样液各2ml放入50ml试管中，每支试管中加入蒽酮试剂8.0mL，迅速浸于流动自来水中冷却，各管加完后摇匀，一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴沸腾起计时，准确煮沸l0 min，取出，用自来水冷却至室温，在620 nm波长下，将0 ug/ml、20ug/ml、60ug/ml、100ug/ml标准显色液注入4个10mm比色皿，放入比色槽，输入对应浓度值，建立标准曲线，然后调至浓度页面测定其余各试管样液浓度值。
表4、金花葵多糖*及可溶性糖含量
样号
样品名
显色浓度
ug/ml
提取液定容体积
ml
稀释倍数
多糖含量
%
1
茎下部
36.05
200
5
1.80
2
枝条下部
39.40
200
5
1.97
3
根
97.20
200
5
4.86
4
枝条上部
13.70
200
5
0.68
5
花
107.90
200
5
5.39
1ˊ
茎下部
96.15
200
10
9.61*
2ˊ
枝条下部
79.30
200
10
7.93*
3ˊ
根
101.60
200
10
10.16*
4ˊ
枝条上部
27.60
200
10
2.76*
5ˊ
花
159.00
200
10
15.90*
表5、金花葵有效物质含量
样号
样品名
总黄酮含量
%
总多糖含量
%
可溶糖含量
%
总糖含量
%
1
茎下部
3.20
9.61
1.80
11.41
2
枝条下部
2.20
7.93
1.97
9.90
3
根
2.50
10.16
4.86
15.02
4
枝条上部
3.15
2.76
0.68
3.44
5
花
18.25
15.90
5.39
21.29
五、结论
从表1中可以看到，金花葵生物黄酮含量非常高：花中含量最高，达到18.25%，如按亩产100kg干花计算，可产18.25kg总黄酮；其次是植株，平均达到2.76%，如按亩产1000kg干植株计算，可产27.6kg总黄酮；两者相加，每亩总计可产45.85kg总黄酮，经济价值非常可观。
从表4中可以看到，金花葵生物多糖含量同样非常高：花中含量最高，达到15.9%，如按亩产100kg干花计算，可产15.9kg生物多糖；其次是植株，平均达到7.62%，如按亩产1000kg干植株计算，可产76.2kg生物多糖；两者相加，每亩总计可产92.1kg生物多糖，经济价值更是无法估算。
从表5中还可以看到，金花葵全株药用成分总含量极高：在干物质亩产总量至少可以达到1100kg（未计叶产量）的前提下，生物黄酮平均总含量至少可以达到4.17%，生物多糖平均总含量至少可以达到8.37%，全株无任何废弃物，具有极高的综合经济开发利用价值。
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